- 標(biāo)記二抗的選擇及應(yīng)用實(shí)例
- 點(diǎn)擊次數(shù)：2486 更新時(shí)間：2016-01-24
- 標(biāo)記二抗的作用
二抗是在其它宿主體內(nèi)制備的能與一抗或一抗片段結(jié)合的抗體，上面通常連有酶或熒光素等標(biāo)簽。由于標(biāo)記二抗所具備的優(yōu)點(diǎn)使得其在免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)中得以應(yīng)用廣泛，如western blot(通過與特異性抗體結(jié)合來鑒定蛋白質(zhì))，ELISA，免疫組織化學(xué)(檢測組織中的特異性抗原)，免疫細(xì)胞化學(xué)(通過免疫學(xué)方法檢測細(xì)胞的抗原組成)，流式細(xì)胞術(shù)及免疫沉淀(通過抗原與抗體的特異性結(jié)合作用來分離相應(yīng)抗原)。
二抗針對某一特定物種(如小鼠)的所有抗體均具有特異性，因而使用標(biāo)記二抗可以免去對每一個(gè)一抗進(jìn)行標(biāo)記，大大節(jié)省了時(shí)間和費(fèi)用;此外，一個(gè)一抗分子可以同時(shí)結(jié)合幾個(gè)二抗分子，從而使信號大大增強(qiáng)，提高了實(shí)驗(yàn)靈敏度。
標(biāo)記二抗可以耦聯(lián)有幾種不同的標(biāo)記，可以是酶，熒光素，或生物素。
標(biāo)記二抗的選擇
通常情況下，某一特定的實(shí)驗(yàn)中可能同時(shí)有幾種二抗可供選擇，如何能選擇到該實(shí)驗(yàn)的二抗，需要綜合以下幾個(gè)方面進(jìn)行考慮：
一抗的物種來源
一抗是在什么物種來源的，相應(yīng)的二抗也要是抗該物種的抗體。例如，如果一抗是在小鼠體內(nèi)制備的，那么你就應(yīng)當(dāng)選擇抗小鼠的二抗，如果一抗是在兔體內(nèi)制備的，那么二抗就應(yīng)當(dāng)是抗兔的抗體。至于二抗本身是在什么動物中制備的對二抗的質(zhì)量并無明顯的影響。
一抗是屬于哪個(gè)類或亞類
二抗需與一抗的類別或亞類相匹配。這通常是針對單克隆抗體而言。多克隆抗體主要是IgG類免疫球蛋白，因此相應(yīng)的標(biāo)記二抗就是抗IgG抗體。單克隆抗體的類別及亞類通常會在產(chǎn)品列表中列出，如果你的一抗是小鼠IgM，那么相應(yīng)的二抗就應(yīng)當(dāng)是抗小鼠IgM，或是抗小鼠IgG抗體。
如果單克隆一抗是小鼠IgG的某一亞類(IgG1，IgG2a，IgG2b，IgG3)，那么幾乎所有的抗小鼠IgG都可以與之結(jié)合，或者你也可以選擇專門針對這一亞類的二抗，例如，如果你的一抗是小鼠IgG1，那么二抗在雙標(biāo)記實(shí)驗(yàn)中尤其適合。
如果你不知道一抗是哪一類別或亞類，那么抗小鼠IgG是一個(gè)不錯(cuò)的選擇，因?yàn)榇朔N抗體可以識別大多數(shù)類型的IgG免疫球蛋白。
標(biāo)記二抗應(yīng)用實(shí)例分析
為分析標(biāo)記二抗的使用情況，我們隨機(jī)抽取了100篇2007年或2008年發(fā)表于Science 或 Journal of Biological Chemistry雜志上的 文章(英文)，這些文章涵蓋了來自于16個(gè)國家的約80個(gè)研究機(jī)構(gòu)。收集的數(shù)據(jù)顯示二抗的使用非常廣泛，可以應(yīng)用到幾乎所有類型的免疫檢測中，尤其是Western blot、免疫組織化學(xué)和免疫細(xì)胞化學(xué)。事實(shí)上，二抗在ELISA及流式細(xì)胞術(shù)中應(yīng)用也很廣泛，不僅用于科學(xué)研究，而且廣泛的應(yīng)用于臨床分析和疾病診斷。比較而言，二抗在免疫沉淀中的應(yīng)用相對較少。以下內(nèi)容是基于對所收集的二抗信息進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析后得出的一些結(jié)論，對于您在具體的實(shí)驗(yàn)中如何選擇的抗體具有借鑒作用。
選擇二抗時(shí)，您必須考慮到以下因素，如一抗的物種、產(chǎn)生二抗的宿主、一抗的類別或亞類、二抗所耦聯(lián)的探針類型及二抗的形式(如整個(gè)IgG分子，F(xiàn) (ab’) 2片段，或Fab片段)等等。因此選擇哪種類型的二抗很大程度上決定于您所使用的一抗是什么，尤其針對種屬和類別而言。通常情況下，一抗可以在山羊、小鼠、兔子、大鼠及綿羊體內(nèi)制備，其中屬小鼠及兔子zui為常見，相應(yīng)的，標(biāo)記二抗的種屬也應(yīng)當(dāng)與一抗的相一致。而對于制備二抗的宿主，則應(yīng)選擇另外一種不同的動物，一般選用驢、山羊、兔子、綿羊或其他較大的動物，可以實(shí)現(xiàn)二抗的大規(guī)模制備，其中又屬山羊使用zui多。
對于二抗類別或亞類的選擇，應(yīng)遵循與一抗類別或亞類相一致的原則，其中抗IgG使用zui多。這可能是因?yàn)槌宋宸N類別的單克隆抗體外，很多一抗是多克隆抗體，屬于IgG類免疫球蛋白。此外anti-IgG可以識別幾乎所有類型的IgG亞類，因此，在不清楚一抗是屬于那個(gè)類別或亞類的時(shí)候，anti-IgG抗體是個(gè)不錯(cuò)的選擇。從我們的數(shù)據(jù)來看，值得注意的是， IgG亞類特異性的二抗(如抗IgG1，抗IgG2，抗IgG2a，抗IgG2b)通常用于雙標(biāo)記實(shí)驗(yàn)中，包括免疫細(xì)胞化學(xué)、免疫組織化學(xué)及流式細(xì)胞術(shù)。
此外，整個(gè)IgG分子是zui常用的一種二抗分子形式，而F (ab’) 2片段或Fab片段一般僅用于特殊實(shí)驗(yàn)中，如需要避免抗體與具有Fc受體的細(xì)胞結(jié)合的情況，或需要封閉內(nèi)源性免疫球蛋白的時(shí)候。
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